Kyai Ageng Muhammad Besari memiliki silsilah keturunan dari Majapahit dan dari Nabi Muhammad SAW. Dimana keturunan Majapahit berasal dari ayahnya yakni Ki Ageng Anom Besari atau Ki Ageng Grabahan dari Dusun Kuncen, Caruban Madiun. Sedangkan keturunan Nabi Muhammad SAW didapat dari ibunya yakni Nyai Anom Besari atau Nyai Ruqiyah yang nasabnya sampai kepada Rasulullah SAW melalui garis Sayyidati Fatimah Az-Zahra.
Kentalnya unsur budaya Jawa pada masjid ini diperkuat dengan 36 tiang kokoh dari kayu jati tanpa paku (dikuatkan menggunakan pasak berupa kayu). Jumlah tiang mengandung arti jumlah wali/wali songo (3+6=9) yang menyebarkan agama Islam di Pulau Jawa dan atap berbentuk kerucut mengambarkan keagungan Allah SWT.
Tidak hanya itu, kubah masjid terbuat dari tanah liat (sejenis gerabah) yang masih terjaga keasliannya hingga sekarang. Dilansir dari laman warisan budaya Kemendikbud, kekunoan arsitektur Masjid Tegalsari di samping dapat dilihat dari konteks dan keletakan, juga dari unsur fisik masjid yang lain, seperti adanya pagar keliling yang mengitari kompleks masjid.
